查理五世遜西班牙王位。

查理五世為天主教奉獻了全部忠誠乃至狂熱。他是宗教改革運動的激烈反對者，並企圖建立一個“世界天主教帝國”。1521年，查理五世以皇帝身份傳喚馬丁·路德參加沃爾姆斯宗教會議（許諾保證路德的人身安全）。他在這次會議上宣布路德及其追隨者為非法（1521年沃爾姆斯敕令）。
1524年有鑒於德國爆發農民起義而新教諸侯組成了施馬爾卡爾登聯盟，查理五世決定把德意志事務交給弟弟斐迪南（即日後的斐迪南一世）全權辦理。
1545年特倫特公會議的召開宣告了歐洲天主教勢力反對宗教改革的浪潮的開始。查理五世決心懲罰德意志的新教王公。1546年查理五世與施馬爾卡爾登聯盟開戰。在戰爭的第一階段（1546年—1548年）他打敗了薩克森選侯約翰·腓特烈, 並將投降的黑森侯爵（慷慨的）腓力一世監禁起來（1547年—1552年）。然而，他是先勝後敗。新的戰事於1552年爆發後，查理五世遭到一系列失利，遂與諸侯簽訂1555年奧格斯堡宗教和約。